《发酵食品中氨基甲酸乙酯的快速检测研究》成果登记公示

登记日期：

2020-10-09

完成单位：

仲恺农业工程学院

完成人员：

刘功良,李南薇,钱敏,高苏娟,黄桂颖,马磊,朱宝生,白卫东

研究起止日期：

2014-10-31至2017-10-31

主要应用行业：

农、林、牧、渔业

高新技术领域：

现代农业

评价单位：

广东省科学技术厅

评价日期：

2018-04-08

成果简介：

本项目是由仲恺农业工程学院为承担单位的广东省科技计划项目。项目名称为：发酵食品中氨基甲酸乙酯的快速检测研究，项目编号为：2013B020311019。 氨基甲酸乙酯已被世界卫生组织划列为2A类的致癌物，具有强烈的胃毒性和致癌性。氨基甲酸乙酯主要是由食品微生物（特别是酿酒酵母）代谢过程产生的尿素和乙醇进行自发反应生成的，其生成机理非常复杂。传统食品发酵过程中产生的尿素绝大部分来源于各种氨基酸代谢，其中最为重要的是精氨酸。精氨酸在粮食原料中含量较高，是食品微生物在发酵过程中的重要氮源。以黄酒为例，黄酒中精氨酸含量十分丰富，精氨酸降解生成鸟氨酸及尿素，尿素与乙醇作用生成氨基甲酸乙酯，造成黄酒中的氨基甲酸乙酯含量较高，这是氨基甲酸乙酯的主要形成途径之一。 发酵食品和酒精饮料样品经过预处理后，通常采用色谱学的方法检测EC的残留含量。目前，检测氨基甲酸乙酯的方法除了经典的气相色谱结合质谱分析方法以外，还有高效液相色谱结合荧光检测器或、傅里叶变换红外光谱结合偏最小二乘回归、核磁共振分光检定法等。上述检测方法的灵敏度和可靠性都很高，但也存在一些缺陷：样品预处理的程序比较复杂，检测成本高，所需仪器昂贵，检测过程只能在具有大型、贵重仪器的专业实验室内进行，难以适应市场产品的现场抽查、生产企业的自查及产品进出口快速通关检测的要求。 本研究从间接检测EC的思路出发，首次建立了可检测EC的免疫检测方法。首先，基于EC占吨聚衍生物XEC的结构，分别在其芳香环上的C-2、C-3位引入羧基及末端为羧基的手臂，合成两种半抗原，制备免疫原，成功获得了特异性识别的XEC的多克隆抗体，并利用该多抗构建了基于衍生间接检测EC的ic-ELISA方法。通过对ELISA参数的优化及EC衍生条件的优化，仅需对样品进行简单的稀释及快速的衍生（5 min），即可用该ic-ELISA方法对黄酒中EC进行测定。该方法用于黄酒中EC的检测，LOD为166 μg/L，黄酒中样品添加回收率在84.4% ~ 100.9%之间，变异系数在8.2% ~ 9.5%之间。 由于氨基甲酸乙酯由于分子量极小，结构简单，制备其特异性抗体尚无法实现。本研究首次将EC与9-氢占吨衍生化，提高EC分子量，制备其衍生物XEC的特异性抗体，建立检测XEC的免疫分析方法。检测时，只需将EC和9-氢占吨衍生后即可快速测定，通过定量XEC对EC进行含量检测，由于衍生过程简单，衍生率高，该方法具有特异性高、灵敏度高、简单快速、成本不高等优点，可作为费时费力的色谱分析方法的补充，成为半定量筛选和定量分析的工具。 本项目开发了免疫检测试剂，建立发酵食品中氨基甲酸乙酯的酶联免疫吸附检测方法，为发酵食品中氨基甲酸乙酯的快速检测提供技术基础，可作为色谱检测的替代及补充方法，改变氨基甲酸乙酯现有检测技术存在诸多不足的现状，成果推广应用的前景良好。 本项目首次建立了通过检测EC衍生物XEC来实现对EC的快速定量免疫分析方法。检测的时候仍需对EC进行衍生化，虽然衍生时间只需30min，仍然增加了检测步骤和时间。后续可以对EC特异性抗体的制备进一步深入研究，通过优化免疫半抗原结构、包被本抗原结构、筛选适配体等手段，获得特异性识别EC的抗体，建立直接检测EC的快速免疫方法。 发表SCI收录论文2篇： 1. Development of an indirect ELISA for the determination of ethyl carbamate in Chinese ricewine [J]. Analytica Chimica Acta, 2017, 950:162-169. 2. An improved HPLC-FID for fast and simple detection of ethyl carbamate in soy sauce and prediction of precursor substance[J]. Food Analytical Methods, 2017, 6: 1-10 申请发明专利1件： 一种呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原、人工抗原及其应用，专利申请号201610675358.3